Efecto de la suplementación dietética del aceite esencial de eucalipto (Eucalyptus globulus Labill) en lechones posdestete mantenidos en cama profunda

W O Caicedo^1,2,3, Y Arteaga¹, D Sancho¹, Derwin Viáfara¹, J Reyes¹, L López¹, Yajaira Poveda¹, J Sucoshañay¹ y S Luna Fox¹

¹ Facultad de Ciencias de la Tierra, Universidad Estatal Amazónica, Puyo, Pastaza, Ecuador
orlando.caicedo@yahoo.es
² EMPRESA PROAMAZA CAICEDO S.A.S. B.I.C, parroquia Tarqui, Puyo, Pastaza, Ecuador
³ Agroveterinaria Caicedos, parroquia Tarqui, Puyo, Pastaza, Ecuador

Resumen

En esta investigación se evaluó el efecto de la suplementación dietética del aceite esencial del follaje de eucalipto (Eucalyptus globulus Labill) en indicadores productivos de lechones en posdestete mantenidos en cama profunda. El estudio tuvo dos etapas: 1) la extracción y caracterización del aceite esencial (AE) se hizo en el Laboratorio de Bromatología de la Universidad Estatal Amazónica y; 2) la determinación de indicadores productivos: peso final (PF), consumo de alimento día (CAD), ganancia de peso día (GPD), conversión alimentaria (CA); y comprobación de parásitos (Coccidios, Strongyloides y Ascaris) en las instalaciones de cerdos de la empresa “PROAMAZA CAICEDO S.A.S. B.I.C”. Se utilizó 36 lechones posdestete, 10 por cada tratamiento, peso promedio 13.18 ± 0.21 kg, cruce (Duroc x Pietrain x Blanco Belga), distribuidos de forma aleatoria, durante 28 días. Los tratamientos consistieron en: control sin aditivo; Toltrazuril 2 mL dosis única; y AE de eucalipto 2 mL dosis única.

El AE presentó una alta concentración de eucaliptol (75.56%), 2–pineno (16.68%) y terpineol (2.92%). Los mejores (p<0,05) PF, GPD y CA presentaron los animales tratados con AE de eucalipto y Toltrazuril, respectivamente. Además, al culminar la investigación, los cerdos tratados con AE de eucalipto y Toltrazuril, no presentaron los parásitos gastrointestinales; Coccidios, Strongyloides y Ascaris.El uso de AE de eucalipto, promueve mejoras sobre el PF, GPD, CA y limita el crecimiento de parásitos gastrointestinales como Coccidios, Strongyloides y Ascaris,constituyendo una alternativa natural al uso de aditivos sintéticos que causan resistencia de los agentes patógenos y afectan la salud del consumidor.

Palabras claves: aditivo natural, arrastre de vapor, cerdos posdestete, eucaliptol, parásitos gastrointestinales

Effect of dietary supplementation of eucalyptus essential oil (Eucalyptus globulus Labill) in post-weaning piglets kept in deep bedding system

Abstract

In this research, the effect of dietary supplementation of the essential oil of eucalyptus foliage ( Eucalyptus globulus Labill) on productive indicators of post-weaning piglets kept in deep bedding was evaluated. The study had two stages: 1) the extraction and characterization of the essential oil (EO) was done in the Bromatology Laboratory of the Universidad Estatal Amazónica and; 2) the determination of productive indicators: final weight (FW), feed consumption per day (FCD), weight gain per day (WGD), feed conversion (FC); and verification of parasites (Coccidia, Strongyloides and Ascaris) in the pig facilities of the company “PROAMAZA CAICEDO S.A.S. B.I.C”. 36 post-weaning piglets were used, 10 for each treatment, average weight 13.18 ± 0.21 kg, crossbreed (Duroc x Pietrain x Belgian White), randomly distributed for 28 days. The treatments consisted of: Control without additive; Toltrazuril 2 mL single dose; and Eucalyptus EO 2 mL single dose.

The EO presented a high concentration of eucalyptol (75.56%), 2-pinene (16.68%) and terpineol (2.92%). The best (p<0.05) FW, WGD and FC presented the animals treated with Eucalyptus EO and Toltrazuril, respectively. In addition, at the end of the investigation, the pigs treated with Eucalyptus EO and Toltrazuril did not present the gastrointestinal parasites Coccidia, Strongyloides and Ascaris. The use of Eucalyptus EO promotes improvements on FW, WGD, FC and limits the growth of gastrointestinal parasites such as Coccidia, Strongyloides and Ascaris, constituting a natural alternative to the use of synthetic additives that cause resistance of pathogens and affect health of the consumer.

Keywords: natural additive, steam entrainment, post-weaning pigs, eucalyptol, gastrointestinal parasites

Introducción

A nivel mundial, la producción porcina tiene gran importancia debido a la demanda de carne y derivados de esta especie pecuaria, contribuyendo de esta manera en la seguridad alimentaria de todos los países. Por otra parte, varios expertos concuerdan que en la etapa de posdestete, los lechones presentan grandes cambios en su morfología y fisiología digestiva, provocando estrés alimenticio por la transición de la dieta, ligado a esto hay un efecto directo que actúa sobre el epitelio y la flora intestinal causando el complejo de la mala absorción fisiológica con la consecuente aparición de nutrientes no absorbidos en la zona ileal, conocido como freno ileal (Lallès et al 2007). Además, otro gran problema detectado en esta etapa, constituyen las enfermedades parasitarias provocadas por diferentes especies de Eimeria spp e Isospora suis, Hyostrongilus rubidus, Strongyloides ransom, Oesophagostomun dentatum, Trichuris suis, Ascaris suum, etc. Los parásitos, atacan a nivel del sistema digestivo y respiratorio causando disminución en la conversión alimenticia, presencia de diarreas, aislamiento, inapetencia y la muerte del animal (Pettersson et al 2021).

En este sentido, en la industria de alimentos para cerdos de posdestete en Ecuador es muy frecuente el uso de fármacos sintéticos, con la finalidad de evitar los trastornos digestivos en los animales (Caicedo et al 2023). Sin embargo, por el uso indiscriminado de estos productos se genera resistencia microbiana y además se han encontrado residuos en la canal porcina (Flores et al 2015).

Por otro lado, en la actualidad, la ciencia se está volcando en investigaciones con el uso de aditivos naturales que puedan sustituir total o parcialmente los productos sintéticos, entre estas alternativas, un campo de reciente investigación, constituyen los aceites esenciales de diferentes especies vegetales. Estos aditivos mejoran el aroma y sabor, aumentando la palatabilidad del alimento (Maenner et al 2011). Además, los principios activos de los aceites esenciales participan en la modificación de la microbiota intestinal y en la inmunidad de los animales, y son capaces de mejorar la arquitectura de la morfología intestinal, por ende, se mejoran los procesos de digestión y absorción de nutrientes, obteniéndose menor gasto energético y disminución de la inflamación intestinal (Chávez-Soto et al 2021; Maya-Ortega et al 2021). El objetivo de esta investigación consistió en evaluar el efecto de la suplementación dietética del aceite esencial del follaje de eucalipto (Eucalyptus globulus Labill) en indicadores productivos de lechones en posdestete.

Materiales y métodos

Localización del experimento

La investigación se realizó en dos etapas: 1) la extracción y caracterización de los aceites esenciales se hizo en el Laboratorio de Bromatología de la Universidad Estatal Amazónica, localizado en el cantón y provincia de Pastaza, Ecuador, en la vía a Napo, km 2 ½ sector paso lateral perteneciente a la cuidad de Puyo entre las coordenadas; norte 9830185 y este 832416, con una altitud de 949 m.s.n.m y; 2) el comportamiento productivo y evaluación de parásitos en los animales se realizó en las instalaciones de cerdos de la empresa “Productora, Procesadora y Comercializadora Amazónica de Productos Agropecuarios Caicedo S.A.S. B.I.C”, localizada entre las coordenadas norte 9837568 y este 166494 con una altitud de 931 m.s.n.m, parroquia Tarqui del cantón Pastaza, temperatura promedio entre 18 y 28 °C, presenta un clima subtropical semicálido o húmedo, con una humedad relativa media de 87% y una precipitación anual de 4000 a 4500 mm (INAMHI 2014).

Proceso de extracción del aceite esencial (AE) del follaje de Eucalipto

Se recogió el follaje tierno de las partes bajas de la planta, en una plantación de eucalipto de 5 años de establecida, ubicada en la ciudad de Ambato, parroquia Montalvo, provincia de Tungurahua, y se trasladaron hacia el Laboratorio de Bromatología de la Universidad Estatal Amazónica, inmediatamente se procedió con el lavado, escurrido y pesaje del follaje, posteriormente se colocó 10 kg de follaje en el extractor de AE por 2 horas. La extracción del AE se hizo por la técnica de arrastre por vapor, en este proceso, se rompe la cámara de almacenamiento del aceite esencial con la carga y libera el aceite hacia el vapor, el vapor con el aceite sube al condensador donde se enfría con agua, causando que este se condense y forme agua y es recibido en un balón de destilación, y separando el agua con el aceite, una vez que se obtuvo el aceite, se enfrió y se guardó en frascos ámbar, y se puso en refrigeración hasta su uso (Arteaga et al 2019).

Determinación de principios activos del AE del follaje de eucalipto

Para la determinación de principios activos en el aceite esencial se empleó un cromatógrafo de gases con detector de ionización en llama (FID). Primero se preparó 5 mL de muestra y se agregó sulfato de sodio para eliminar cualquier residuo de agua, posteriormente, se tomó 0,05 mL de aceite esencial para colocarlo en un matraz aforado de 5 mL el mismo que se aforó con hexano (grado HPLC), y una vez aforado se trasvasó la muestra del matraz de 5mL a un recipiente de vidrio o viales con capacidad de 1 mL, finalmente se colocó en el cromatógrafo para determinar los principios activos del AE de eucalipto.

Manejo de animales e instalaciones

Durante la investigación se cumplió con la normativa de Bienestar Animal de la República de Ecuador (AGROCALIDAD 2017), y el protocolo experimental según los lineamientos de Sakomura and Rostagno (2007). Se utilizaron un total de 30 lechones posdestete, machos castrados y hembras en proporción 1:1, cruce comercial (Blanco Belga x Duroc x Pietrain) de 35 días de edad (Foto 3), con peso vivo promedio de 13.18 ± 0.21 kg. Los animales se ubicaron en un galpón de 10 metros de largo y 6 metros de ancho (60 m²), con paredes laterales de bloque perforado y piso de hormigón, el techo en aleación de zinc y ventilación manual a través de cortinas de lona. Se realizo 6 divisiones de 10 m², y se puso 6 animales en cada una, la división disponía de un comedero tipo tolva y un bebedero de chupón. Previo el ingreso de los animales, la nave estaba provista con cascarilla de arroz. Se aplicó un plan sanitario adecuado en toda la nave, cada 3 días, para evitar la presencia de roedores y moscas que son vectores primarios o secundarios de agentes infecciosos (Mata-Haro et al 2012).Se comprobó el consumo de alimento día (CAD), ganancia de peso día (GPD), conversión alimentaria (CA), y peso final (PF). El pesaje de los animales se realizó cada semana, durante 28 días, con una balanza digital electrónica marca cale con capacidad para 50 kg.

Manejo del alimento y control de tratamientos

La dieta basal se formuló siguiendo las recomendaciones de Rostagno et al (2017) (Tabla 1). Los tratamientos bajo estudio consistieron en: Control sin aditivo; Toltrazuril 2 mL dosis única en el primer día; y AE de eucalipto 2 mL dosis única en el primer día. La formulación balanceada se hizo cada semana y se dispuso a voluntad en comederos tipo tolva una vez por día a las 08:00 am. El agua se mantuvo de forma permanente en bebederos de chupón.

Muestreo de heces para comprobar la presencia y/o ausencia de parásitos

Al inicio de la investigación, día cero, y al finalizar el experimento 28 días, se identificó, pesó y se tomó muestras de heces, en 4 cerdos de cada tratamiento, para facilitar la recogida de muestras y evitar la contaminación, los animales se pusieron en una jaula de 120 cm de largo x 60 cm de ancho por un lapso de 10 minutos. Luego de la recolección, las muestras se trasladaron al Hospital Veterinario la Guardia, para evaluar la presencia de los parásitos (Coccidios, Strongyloides y Ascaris) por el método de flotación, mismo que permite identificar las especies parasitarias y determinar su grado de infestación, es un método cualitativo y cuantitativo, se basa en que los huevos de los parásitos se separan de las masas fecales usando soluciones de peso específico elevado, esto permite evaluar la gravedad de la carga parasitaria que puede ser: leve, moderada o grave (Sierra et al 2015).

Diseño experimental y análisis estadístico

El experimento se condujo bajo un diseño completamente aleatorizado con medidas repetidas, en el cual se probó el efecto de los tratamientos sobre las variables objeto de estudio. Todos los datos se procesaron con el paquete estadístico Infostat (Di Rienzo et al 2020). En los casos necesarios, se aplicó la prueba de Duncan (1955) para comparar las medias con un nivel de significación del 5%.

Resultados y Discusión

En la tabla 2 se muestran los componentes bioactivos del aceite esencial de eucalipto. La mayor concentración se obtuvo para: Eucaliptol (75.56%), 2–Pineno (16.68%) y Terpineol (2.92%) y la menor concentración para el Ácido butanoico, éster de 3-metil-, 1-etenil-1,5-dimetil-4-hexenil (0.24%).

Estudios realizados por Nolazco-Cama et al (2020) referente a la extracción y caracterización en AE de eucalipto mediante el método de hidrodestilación por arrastre de vapor (HD) e hidrodestilación asistida por microondas (MWHD) obtuvieron un mayor valor para eucaliptol (85,40% - 89,89%), y menor concentración para α-pineno (5,40% - 5,50%) y α-terpineol (0,45% - 0,54%), estos metabolitos actúan como antiparasitarios en el tracto digestivo y respiratorios (eucaliptol), tienen propiedades antiinflamatorias y antimicrobianas (α-pineno), y terpineol con efecto antifúngico, antioxidante y puede llegar a ser un gran conservador del alimento, además, actúa como promotor de crecimiento, mejorando de esta manera el consumo de alimento, ganancia de peso y conversión alimentaria de los animales (Albado-Plaus et al 2001).

El mejor (p<0.05) peso vivo final (PF), ganancia de peso día (GPD) y conversión alimentaria (CA) se obtuvieron en los animales tratados con AE de eucalipto y Toltrazuril. No hubo diferencias (p>0.05) para el consumo de alimento día (CAD) entre los tratamientos (Tabla 3).

Los mejores resultados obtenidos en el presente estudio, están en correspondencia a lo obtenido por otras investigaciones con suplementación dietética de AE y aditivos sintéticos en cerdos. Janacua-Vidales et al (2018), mencionan que con la suplementación de AE de orégano en cerdos, se incrementaron los pesos finales en 2%, mejorando de esta manera el rendimiento de la explotación porcina. De igual manera, Parrado et al (2006) describen un incremento en el peso final de lechones que fueron suplementados con AE de orégano, superando a la dieta con antibióticos y promotores de crecimiento sintéticos.

En otro estudio, Buenaño-Haro and Bravo-Sánchez(2022) emplearon una mezcla de AE de jengibre y cúrcuma en relación 50:50, suplementada en la dieta con tres niveles (0.01; 0.05 y 0.1%), durante 28 días, la ganancia de peso por día aumentó a medida que se incrementó el nivel de suplementación dietética (0.401; 0.421 y 0.436 kg/día). Un comportamiento similar fue reportado por Caicedo et al (2023) quienes evaluaron la suplementación dietética con AE de ajo de monte en dos dosificaciones (500 y 1000 mg.kg MS^-1), y concluyeron que a medida que se incrementó el nivel de AE se evidenció un incremento numérico sobre el desempeño productivo (GPA, CA y PF) a favor de los animales tratados, respecto al control.

En la tabla 4 se presentan los resultados de las cargas parasitarias en cerdos posdestete sin tratamiento y tratados con Toltrazuril y AE de eucalipto, respectivamente. Al iniciar la investigación, en todos los tratamientos, se constató la presencia de Coccidios, Strongyloides y Ascaris, sin embargo, al finalizar la experimentación de 28 días, en los animales que se suministró Toltrazuril y AE de eucalipto hubo ausencia de estos parásitos.

En la tabla 4, se muestra la presencia de parásitos en los cerdos sin tratamiento y con suplementación dietética de Toltrazuril y AE de Eucalipto, entre cero y 28 días. Estos resultados concuerdan con otras investigaciones realizadas en base al uso de productos sintéticos y aceites esenciales en lechones posdestete, implementando en la dieta o en el agua de bebida.

De acuerdo con Coutinho Luna et al (2019), la actividad larvicida, insecticida y antiparasitaria de los AE se han asociado con la inducción de estrés oxidativo en los parásitos, aumentando los niveles de óxido nítrico en el huésped infectado y reduciendo la resistencia de estos al oxígeno reactivo y el aumento de la peroxidación lipídica, esto provoca daños graves a las membranas celulares. Asimismo, la hidrofobicidad de estos compuestos también les permite atravesar las membranas de los parásitos, así como la barrera hematoencefálica, colaborando en el combate en la segunda etapa de varias de estas infecciones.

Por otra parte, existe una serie de ventajas al momento de la aplicación de AE en cerdos posdestete, debido a su capacidad antioxidante mejoran la conversión alimentaria y la ganancia de peso, además, tienen efectos antibacterianos y antiparasitarios, logrando prevenir enfermedades, yno existen problemas de resistencia al medicar en cantidades superiores a los productos sintéticos (Coutinho Luna et al 2019; Buenaño-Haro and Bravo-Sánchez 2022; Caicedo et al 2023).

Conclusiones

• El AE de eucalipto presentó buenas concentraciones de los componentes bioactivos; Eucaliptol (75.56%), 2 – Pineno (16.68%) y Terpineol (2.92%), mismos que presentan efectos antiinflamatorios, antiparasitario, antimicrobianos, antifúngico, antioxidante y conservantes del alimento.
  
  
• El uso de AE de eucalipto, en lechones de posdestete mantenidos en cama profunda, promueve mejoras sobre el PF, GPD, CA y limita el crecimiento de parásitos gastrointestinales como Coccidios, Strongyloides y Ascaris,constituyendo una alternativa natural al uso de aditivos sintéticos que causan resistencia de los agentes patógenos y afectan la salud del consumidor.

Referencias

AGROCALIDAD (Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la Calidad del Agro) 2017 Manual de aplicabilidad de buenas prácticas porcícolas. Quito, Ecuador, pp. 127. http://www.agrocalidad.gob.ec/wp-content/uploads/pdf/Guia-BPA-publicaciones/2017/enero/manual-buenas-practicas-porcicolas-24-01-2017.pdf

Albado-Plaus E, Saez-Flores G and Grabiel-Ataucusi S 2001 Composición química y actividad antibacteriana del aceite esencial del Origanum vulgare (orégano). Revista Medica Herediana, 12(1), 16-19. http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1018-130X2001000100004&lng=es&tlng=es.

Arteaga Y C, Bravo L R S, García Y Q, Tapuy A S C, Del Sol A B and Guzmán D M M 2021 Evaluation of the synergistic effects of antioxidant activity on mixtures of the essential oil from Apium graveolens L., hymus vulgaris L. and Coriandrum sativum L. using simplex-lattice design. Heliyon, 5(6): e01942. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405844018374656

Buenaño-Haro C X and Bravo-Sánchez L R 2022Uso del jengibre (Zinger officinale) y cúrcuma (Curcuma longa) como aditivos fitobióticos en lechones posdestete. Koinonía, 7(14): 32-43. https://doi.org/10.35381/r.k.v7i14.1853.

Caicedo W, Caicedo L, Buenaño C and Caicedo M 2023 Productive performance of post-weaning piglets supplemented with essential oil of wild garlic ( Mansoa alliacea L.). Technical note. Cuban Journal of Agricultural Science, 57: 1-6

Chávez-Soto D, Vázquez-Armijo J, Hernández-Meléndez J, Martínez-González J, Esparza-Jiménez S and López-Aguirre D 2021 Essential oils in small ruminants and their effect on productivity. Tropical and Subtropical Agroecosystems, 24(2): 1-12. https://www.revista.ccba.uady.mx/ojs/index.php/TSA/article/view/3468/1612

Coutinho Luna E, Silva Luna I, Scotti L, Monteiro A F M, Tullius Scotti M, Olímpio de Moura R, Aquino de Araújo R S, Chagas Monteiro K L, Mendonça de Aquino T, Fávaro Ribeiro F and Bezerra Mendonça F J 2019 Active Essential Oils and Their Components in Use against Neglected Diseases and Arboviruses Oxid Med Cell Longev. 6587150. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6387720/

Di Rienzo J A, Casanoves F, Balzarini M G, González L and Robledo C W 2020 InfoStat v. 2020. http://www.infostat.com.ar/

Duncan B 1955 Multiple range and multiple F test. Biometrics, 11: 1-42

Flores L, Elías A, Proaño F, Granizo G, Medina Y, López S, Herrera F and Caicedo W 2015 Effects of a microbial preparation, a probiotic and commercial antibiotic on the productive performance and pig’s health in post-weaning period. Cuban Journal of Agricultural Science, 49(3): 357-365. https://www.redalyc.org/pdf/1930/193042629011.pdf

INAMHI (Instituto Nacional de Meteorología e Hidrología) 2014 Anuario Meteorológico. Quito, Ecuador, p. 28. https://drive.google.com/file/d/1aRysaX9teIQwI4E_U9vtR6XaNBNv4VL9/view

Janacua-Vidales H, Alarcón-Rojo A, Olguín-Arredondo H, Quintero J and Cardona-Hernández M 2018 Aceites esenciales de orégano en la dieta de cerdos para mejorar las características de la canal. CULCyT, 15(65): 85-90

Lallès J P, Bosi P, Smidt H and Stokes C R 2007 Weaning — A challenge to gut physiologists. Livestock Science, 108(1-3): 82-93. https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1871141307000911

Maenner K, Vahjen W and Simon O 2011Studies on the effects of essential-oil-based feed additives on performance, ileal nutrient digestibility, and selected bacterial groups in the gastrointestinal tract of piglets. Journal of Animal Science, 89(7): 2106-2112. https://doi.org/10.2527/jas.2010-2950

Mata-Haro V, Acedo-Felix E and Pinelli-Saavedra A 2012 Bioseguridad. Limpieza y desinfección. En: Susana Verónica del Castillo Pérez, Álvaro Ruíz, Jesús Hernández, Josep Gasa, Editores. Manual de Buenas Prácticas de Producción Porcina. Lineamientos generales para el pequeño y mediano productor de cerdos. Red Porcina Iberoamericana, 2012: 14-25

Maya-Ortega C, Ángel-Isaza J, Martínez-Morales B and Parra-Suescún J 2021 Oregano essential oil (Lippia origanoids) improves productive parameters and blood metabolites in piglets". Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial, 19(2): 82-93. https://doi.org/10.18684/bsaa.v19.n2.2021.1547

Nolazco-Cama D, Villanueva-Quejia E, Hatta-Sakoda B and Tellez-Monzon L 2020 Extracción y caracterización química del aceite esencial de Eucalipto obtenido por microondas y ultrasonido. Rev. Investig. Altoandin, 22(3): 274-284. http://dx.doi.org/10.18271/ria.2020.661.

Parrado S, Chamorro J and Serrano L 2006 Estudio preliminar: orégano como promotor de crecimiento en lechones destetados. Revista de Medicina Veterinaria, (12), 81-88.

Pettersson E, Sjölund M, Wallgren T, Lind E O, Höglund J and Wallgren P 2021 Management practices related to the control of gastrointestinal parasites on Swedish pig farms. Porcine Health Management, 7:12. https://doi.org/10.1186/s40813-021-00193-3

Rostagno H S, Albino L F T, Donzele J L, Gomes P C, Oliveira R F, Lopes D C, Ferreira A S, Barreto S L T and Euclides R F 2017 Tabelas Brasileiras para Aaves e suínos: Composição De Alimentos e Exigências nutricionais, 4rd. Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Brazil.

Sakomura N and Rostagno H 2007 Métodos de pesquisa em nutrição de monogástricos. Jaboticabal: FUNEP, pp. 283.

Sierra-Cifuentes V, Jiménez-Aguilar J, Alzate-Echeverri A, Cardona-Arias J and Ríos-Osorio L 2015 Prevalencia de parásitos intestinales en perros de dos centros de bienestar animal de Medellín y el oriente antioqueño (Colombia), 2014. Revista de Medicina Veterinaria, 30 (55-66). https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=5190500